PCR digitale
La plateforme est équipée pour la PCR digitale des systèmes Biomark-HDTM de Fluidigm et NaicaTM de Stilla Technologies
La PCR digitale permet de quantifier directement un élément de génome (ADN ou ARN) dans un échantillon biologique ou environnemental. Le principe général consiste à discrétiser l’échantillon (le répartir équitablement) dans un grand nombre de chambres réactionnelles indépendantes qui contiendront soit 1 ou 0 copie de l’élément à quantifier. Chaque chambre (ou partition) se comporte comme un réacteur à PCR indépendant, où les chimies fluorescentes utilisées en qPCR (sondes à hydrolyse ou hybridation, intercalant de l’ADN) associées aux amorces choisies, permettront l’amplification spécifique des éléments ciblés. A l’issue de la PCR les partitions positives et négatives sont comptées et rapportées au nombre total de partitions. La distribution statistique de la molécule cible dans les compartiments suit une loi de Poisson (statistique des évènements rares) et qui permet d’estimer précisément la quantité initiale d’ADN ou ARN dans un échantillon testé. Cette approche permet ainsi une quantification absolue des molécules cibles dans l’échantillon et est particulièrement adaptée à la détection d’évènements rares.
La sensibilité de détection dépend principalement du nombre total de compartiments individuels, et donc de séquences cibles pouvant être analysées. Elle est d’autant plus élevée que le nombre de compartiments est grand. Les nouvelles technologies microfluidiques de PCR digitale permettent d’obtenir un grand nombre de compartiments sous forme de microchambres ou de nanogouttelettes. La plateforme s’est donc équipée de deux technologies :
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- PCR digitale en microchambres (dPCR) avec le système Biomark-HDTM de Fluidigm
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- PCR digitale en nanogouttelettes à haute résolution (cdPCR) avec le système NaicaTM de Stilla Technologies
dPCR
Les puces Digital Array de Fluidigm permettent de répartir (ou discrétiser) l’échantillon dans 765 ou 770 chambres réactionnelles d’une puce microfluidique. Chaque puce est constituée de chambres réactionnelles de petits volumes (6nL ou 0.85nL) et d’un circuit fluidique intégré (IFC pour Integrated Fluidic Circuit). Cet ensemble de micro-canaux connectés entre eux permet la circulation des fluides (échantillons, mix et amorces) et leur distribution dans des chambres réactionnelles. La circulation des fluides est assurée par un IFC contrôleur, qui, par des différences de pression, provoque l’ouverture ou la fermeture des valves NanoFlexTM pour la distribution et le mélange des échantillons et des amorces. L’amplification et la lecture de la fluorescence (2 canaux de détection) sont assurées par le système Biomark-HD™ lui-même. Après plusieurs cycles de PCR, la concentration d’un ADN ou ARN cible est déterminée à partir du rapport entre le nombre de chambres positives (où au moins une copie de la séquence d’ADN ou ARN étudiée a été amplifiée) et le nombre total de chambres réactionnelles. L’application de la loi de Poisson sur ce rapport, permet d’estimer précisément le nombre initial de copies de la cible d’intérêt dans l’échantillon.
cdPCR
Le système Naica™ de Stilla Technologies propose une technique de détection et de quantification très sensible des acides nucléiques appelée Crystal Digital™ PCR (cdPCR). Cette technique microfluidique est basée sur l’utilisation de gouttelettes aqueuses dispersées dans de l’huile pour compartimenter un grand nombre de réactions PCR indépendantes. Des dizaines de milliers de nanogouttelettes (20 000 à 30 000 selon les formats de puce) sont assemblées en cristal de gouttes au sein d’une puce. Les gouttelettes de tailles identiques sont stabilisées par des agents tensioactifs pour éviter la coalescence. Ainsi les molécules cibles (ADN, ARN, miRNA, mutants), identifiées par différents fluorochromes, peuvent être amplifiées de manière indépendante dans les gouttelettes à raison de 1 molécule maximum par compartiment. Un signal lumineux est mesuré au sein de chaque gouttelette pour déceler la présence ou l’absence de la molécule d’intérêt et ainsi déterminer directement le nombre de copies de la molécule cible dans un échantillon biologique. Chaque puce intègre 4 ou 16 cristaux de gouttes (selon les formats de puce) pour l’analyse de 4 ou 16 échantillons/puce. Capacité d’analyse par run de PCR : 3 puces soit 12 à 48 échantillons par run.
Suivant les technologies de dPCR ou cdPCR choisies, 4 formats de puces sont disponibles :
dPCR microfluidique
Puce 12.765
- 12 échantillons répartis dans 765 chambres
- Chambre de 6nL
- 9 180 réactions PCR
Puce dPCR 37k
- 48 échantillons répartis dans 770 chambres
- Chambre de 0,85nL
- 36720 réactions PCR
cdPCR en nanogouttelettes
Puce Sapphire
- Jusqu’à 12 échantillons/run
- 30 000 gouttelettes générées/échantillon
Puce Opale
- Jusqu’à 48 échantillons / run
- 20 000 gouttelettes générées/échantillon
- Quantification absolue des acides nucléiques (ADN, ARN).
- Médecine personnalisée en oncologie (suivi des patients à partir de simples prises de sang).
- Contrôle des thérapies géniques et/ou cellulaires.
- Génotypage des lignées animales ou cellulaires.
- Analyse des anomalies chromosomiques (CNV) et de la présence de polymorphismes (SNP).
- Surveillance de pathogènes dans les eaux usées, identification de variants génétiques viraux.
- Détection d’évènements rares.
- Identification de biomarqueurs présents en faibles quantités dans des fluides biologiques (sang, urine, salive) ou environnementaux.
- Capacité de multiplexage offrant la possibilité de caractériser simultanément plusieurs éléments génétiques dans un même échantillon (3 à 6 canaux de détection), permettant l’utilisation optimale d’échantillons précieux et/ou rares.
- Encapsulation et amplification sur noyaux ou cellules uniques.
Avantages de l’approche par PCR digitale
- Précision et quantification directe (n copies/µL)
- Gain de sensibilité : capacité à détecter des évènements rares dans un échantillon (0.01%) ou des biomarqueurs en très faible quantité (0.25 copies/μL)
- Plusieurs canaux de détection de fluorescence : 2 à 6 longueurs d’ondes (bleu, cyan, vert, jaune, rouge, infra-rouge)
- La PCR digitale peut nécessiter la dilution des échantillons pour ne pas saturer les capacités de compartimentation. Les technologies de PCR digitale en émulsion, qui génèrent des nanogouttelettes, doivent être compatibles avec les chimies des mix de PCR afin d’éviter les phénomènes de coalescence.
