qPCR en microfluidique
La plateforme de PCR quantitative à haut débit est équipée du Biomark-HD™ de Fluidigm.
La plateforme de PCR quantitative à haut débit est équipée du Biomark-HD™ de Fluidigm, système qui permet de quantifier simultanément l’expression de dizaines de gènes dans un grand nombre d’échantillons dans des puces microfluidiques.
Chaque puce est constituée de chambres réactionnelles de petits volumes (0.85nL, 6nL ou 9nL) et d’un circuit fluidique intégré (IFC pour Integrated Fluidic Circuit).
Cet ensemble de micro-canaux connectés entre eux permet la circulation des fluides (échantillons, mix et amorces) et leur distribution dans des chambres réactionnelles pour ainsi paralléliser un grand nombre de réactions PCR quantitatives sur une petite surface.
La circulation des fluides est assurée par des IFC contrôleurs, qui, par des différences de pression, provoquent l’ouverture ou la fermeture des valves NanoFlexTM pour la distribution et le mélange des échantillons et des amorces.
L’amplification et la lecture de la fluorescence sont assurées par le système Biomark-HD™ lui-même.
Le Biomark-HD™ de la plateforme est complété par 3 types de contrôleurs IFC (AX, HX et MX) adaptés à 6 formats de puces différents :
Quantification relative : 3 Dynamic Array™
Puce FlexSix
- 6 partitions indépendantes de 12.12
- 12 cibles dans 12 échantillons
- Chambres réactionnelles de 9nL
- 144 à 864 réactions PCR
Puce 48.48
- 48 cibles dans 48 échantillons
- Chambres réactionnelles de 9nL
- 2304 réactions PCR
Puce 96.96
- 96 cibles dans 96 échantillons
- Chambres réactionnelles de 6nL
- 9216 réactions PCR
Préparation de banques de séquençage : 1 Access Array ™
Puce 48.48 Access Array
- De 48 à 4800 amplicons par échantillons
- 48 échantillons par run
Génomique et transcriptomique de la cellule unique
Puce pour capturer 96 cellules individuelles en fonction de leur diamètre
- Puce 5-10µm
- Puce 10-17µm
- Puce 17-25µm
Quantification absolue : 2 Digital Array™
Puce 12.765
- 12 partitions de 765 chambres (12 échantillons)
- Chambres réactionnelles de 6nL
- 9 180 réactions PCR
Puce dPCR 37k
- 48 partitions de 770 chambres (48 échantillons)
- Chambres réactionnelles de 0,85nL
- 36960 réactions PCR
Variation d’expression par quantification relative : comparaison du niveau d’expression des gènes cibles dans différentes conditions expérimentales (contrôle, test ou pathologique). A chaque gène cible correspond une courbe de fluorescence propre à chaque échantillon, d’où est extraite la valeur du Cq (cycle de quantification) caractéristique de la phase exponentielle de l’amplification. Plus le Cq est faible, plus la quantité d’ARN (ARNm, miRNA, ARN antisens, ARN circulaires, convertis en ADNc) initiale est élevée. Les valeurs brutes des Cq des gènes d’intérêts sont normalisées avec les Cq d’un ou plusieurs gènes de référence, dont l’expression ne varie pas dans les différentes conditions expérimentales et qui ont été choisis en amont par le porteur de projet. Les abondances relatives des gènes cibles sont déterminées par les méthodes de Livak (K.J. Livak et al. Methods 2001) ou de Pfaffl (M.W. Pfaffl Nucleic Acids Res. 2001), à l’aide de scripts R développés par la plateforme.
Appliquée à l’ADN génomique la PCR quantitative permet d’analyser les anomalies chromosomiques (CNV), la présence de polymorphismes (SNP), de génotyper des lignées animales ou cellulaires.
Préparation de banques pour le séquençage ciblé : la puce Access Array permet de générer des produits de PCR prêts pour le séquençage à haut débit. Pendant la PCR, des étiquettes (codes-barres) spécifiques à la fois de la méthode de séquençage (paired-end) et de l’échantillon sont ajoutées à chacun des amplicons, ce qui réduit le temps nécessaire à l’enrichissement des séquences cibles avant le séquençage. Cette approche permet de générer jusqu’à 4 800 bibliothèques d’amplicons par échantillon, compatibles avec le séquenceur choisi. Grâce à l’incorporation de codes-barres spécifiques aux échantillons, les produits de PCR d’un IFC 48.48 Access Array sont uniques et peuvent être regroupés et analysés dans une seule expérience de séquençage.
Génomique et trancriptomique de la cellule unique : le système C1 de Fluidigm permet de capturer de 96 à 800 cellules individuelles (selon les puces utilisées) et d’en préparer le matériel génomique pour des analyse de qPCR, RNAseq ou DNAseq.
Les avantages du système Biomark™ HD sont nombreux
- Haut débit : de 144 à 9216 qPCR/puce ou de 9180 à 36720 PCR digitales/puce
- Grande reproductibilité intra et inter-puces (sans nécessité de réplicats techniques)
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- CV intra puce = 0,85%
- CV inter puce = 1,92 %
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- Consommation réduite d’échantillons et de réactifs : volumes réactionnels de l’ordre de quelques nanolitres, soit 1000 fois moins qu’en qPCR classique)
- Flexibilité : le système Biomark™ HD est compatible avec les chimies couramment utilisées en PCR (TaqMan®, EvaGreen®, UPL® Roche, Solaris®…)
- Adapté à tous les types d’échantillons (petite taille, single cell etc.)
La qPCR-HD en microfluidique nécessite néanmoins la préamplification des échantillons (STA : Specific Target Amplification, ou WTA : Whole Transcriptome Amplification) en raison de l’effet de dilution de la puce.
